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NPG 小(xiao)鼠

1.基本信(xin)息

(1)品系名称:NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Vst/Vst

(2)常用名:NPG小鼠

(3)背景:NOD

(4)毛色:白色

(5) 品系建(jian)立:NPG小鼠,是im体育自主研(yan)发的一系(xi)列(lie)高(gao)度(du)免疫缺陷(xian)(xian)大小鼠模(mo)型之一,将获得的Il2rg基(ji)因敲除小鼠,回交到NOD-scid背景建立的高(gao)度(du)免疫缺陷(xian)(xian)模(mo)型。使用该小鼠模(mo)型已经发表了一系(xi)列(lie)高(gao)水平研(yan)究论文[1~12]。


2.制作简介

首先构建了Il2rg基因打靶载体,在B6/129 F1背景的ES细胞上,筛选得到将Il2rg基因敲除的阳性打靶细胞(见图1)。通过囊胚注射的方法,获得了Il2rg基因敲除的ES嵌合小鼠。然后,将ES打靶小鼠,与NOD-scid小鼠回交,从后代中选择Il2rg因基敲除鼠,再与NOD-scid小鼠回交。通过12代的回交,获得并选择Il2rg-雄鼠和Il2rg+/-雌鼠交配,获得PrkdcscidIl2rg-/-小鼠。随后,NOD.PrkdcscidIl2rg-/- 小鼠按照近交系的方式扩繁生产。

 5dc91c3f61400.png

图1. Il2rg 基因(yin)打靶策略示意图



3.质控(kong)检测和表型分析

NPG小鼠(shu)主要包括两个基因(yin)突(tu)变(bian),(1)Prkdc基因(yin)的(de)点(dian)突(tu)变(bian),在(zai)84号外显子上,TAT→TAA,产(chan)生了一(yi)个无效的(de)包含83AA的(de)删短蛋白;(2)Il2rg基因(yin)小鼠(shu),3-8外显子的(de)编码(ma)区被(bei)删除。NPG小鼠(shu)的(de)SNP分(fen)析结(jie)果见(jian)表1,与(yu)NOD-scid (NOD.CB17- Prkdcscid/NcrCrlVr)小鼠(shu)一致。


表1. NPG 和NOD-scid 小鼠SNP分析结果。


SNP ID

Chr-cM

Allele

NPG

NOD-scid

1

RS8253473-SNP1

1-80

V=A, F=C

F F

F F

2

RS13476104-SNP1

1-128

V=C, F=T

V V

V V

3

RS13476435-SNP1

2-35

V=A, F=T

F F

F F

4

RS13476730-SNP1

2-119

V=A, F=T

V V

V V

5

RS13477470-SNP1

3-146

V=A, F=G

V V

V V

6

RS13478001-SNP1

4-135

V=C, F=T

V V

V V

7

RS13478215-SNP1

5-42

V=A, F=C

F F

F F

8

RS13459087-SNP1

5-86

V=A, F=G

F F

F F

9

RS13478818-SNP1

6-73

V=C, F=G

F F

F F

10

RS3710839-SNP1

6-121

V=A, F=G

V V

V V

11

RS3666902-SNP1

7-15

V=T, F=C

VV

VV

12

RS8260975-SNP1

7-34

V=A, F=C

V V

V V

13

RS13479791-SNP1

8-60

V=A, F=G

F F

F F

14

RS4227276-SNP1

8-80

V=C, F=T

F F

F F

15

RS8254841-SNP1

9-38

V=A, F=T

F F

F F

16

RS13480385-SNP1

9-103

V=C, F=T

V V

V V

17

RS13480546-SNP1

10-24

V=C, F=T

F F

F F

18

RS13480803-SNP1

10-123

V=C, F=T

V V

V V

19

RS13480933-SNP1

11-25

V=C, F=G

V V

V V

20

RS3653651-SNP1

11-102

V=C, F=T

F F

F F

21

RS13481624-SNP1

12-99

V=C, F=G

F F

F F

22

RS13481852-SNP1

13-63

V=A, F=C

V V

V V

23

RS13482131-SNP1

14-30

V=C, F=T

V V

V V

24

RS13459176-SNP1

15-3

V=A, F=C

V V

V V

25

RS4170048-SNP1

16-32

V=C, F=G

V V

V V

26

RS13482843-SNP1

17-4

V=C, F=T

V V

V V

27

RS13483295-SNP1

18-35

V=G, F=T

V V

V V

28

RS13483601-SNP1

19-34

V=A, F=G

F F

F F

29

RS13483739-SNP1

X-40

V=C, F=T

V V

V V

30

RS13483962-SNP1

X-109

V=A, F=C

F F

F F



NOD(non-obese diabetes) 背(bei)景适宜人源细(xi)(xi)胞移(yi)(yi)植[13];Prkdc基因突(tu)变,小鼠T、B细(xi)(xi)胞缺失(shi)[14,15];Il2rg蛋白(bai)的gamma链被敲除,其NK细(xi)(xi)胞活(huo)力几乎丧失(shi)[16,17]。因而其基因检测(ce)(ce)(ce)和表型分(fen)析主要(yao)集中在4个方面:①NOD背(bei)景(SNP检测(ce)(ce)(ce));②Prkdc点突(tu)变(PCR检测(ce)(ce)(ce);T、B细(xi)(xi)胞缺失(shi)的流(liu)式检测(ce)(ce)(ce));③Il2rg敲除(PCR检测(ce)(ce)(ce),功能性(xing)NK细(xi)(xi)胞缺失(shi)的流(liu)式检测(ce)(ce)(ce));④细(xi)(xi)胞移(yi)(yi)植重(zhong)建分(fen)析。


(1) NOD背景检(jian)测                                   

NPG小鼠制作使用的NOD-scid小鼠,其遗(yi)(yi)传检测数(shu)据见右(you)上(shang)30个SNP(single nucleotide polymorphism)位(wei)点(dian)信息表,这些位(wei)点(dian)遗(yi)(yi)传标记分布于20条(tiao)染色体。


(2) Prkdc点(dian)突变、Il2rg敲除和(he)NOD背景(jing)(Sirpa基因)检测

Prkdc点(dian)(dian)突变(bian)小(xiao)鼠, 1983年由福(fu)克斯蔡斯癌症中(zhong)(zhong)(zhong)心(Fox Chase Cancer Centre)的(de)(de)(de)(de)Bosma等人发现(xian)[14,15]。Prkdc(protein kinase DNA-activated catalytic)基因(yin)突变(bian),小(xiao)鼠的(de)(de)(de)(de)T和B细(xi)(xi)胞(bao)缺失 ,表(biao)现(xian)为(wei)(wei)(wei)细(xi)(xi)胞(bao)免(mian)疫和体(ti)液免(mian)疫的(de)(de)(de)(de)重度(du)联合(he)免(mian)疫缺陷(severe combined immune deficiency, scid)。Il2rg敲除小(xiao)鼠表(biao)现(xian)为(wei)(wei)(wei)胸腺发育不(bu)全,NK细(xi)(xi)胞(bao)数量减少,活性(xing)丧失[16,17]。目前Prkdc点(dian)(dian)突变(bian)常用(yong)的(de)(de)(de)(de)检(jian)测(ce)(ce)方(fang)法为(wei)(wei)(wei)PCR检(jian)测(ce)(ce);蛋白(bai)(bai)水(shui)(shui)平的(de)(de)(de)(de)检(jian)测(ce)(ce)比(bi)(bi)较(jiao)方(fang)便(bian)的(de)(de)(de)(de)是流(liu)式分(fen)析其外(wai)周血(xue)中(zhong)(zhong)(zhong)T、B淋巴细(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)含量。Il2rg敲除常用(yong)的(de)(de)(de)(de)检(jian)测(ce)(ce)方(fang)法为(wei)(wei)(wei)PCR检(jian)测(ce)(ce);蛋白(bai)(bai)水(shui)(shui)平的(de)(de)(de)(de)检(jian)测(ce)(ce)比(bi)(bi)较(jiao)方(fang)便(bian)的(de)(de)(de)(de)是流(liu)式分(fen)析其脾脏中(zhong)(zhong)(zhong)NK细(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)含量和活性(xing)。NPG小(xiao)鼠采用(yong)上(shang)述方(fang)法进行质(zhi)控,结(jie)果见下图。


image.png

                         2 Prkdc基因PCR检测                                 图3 Il2rg基因PCR检(jian)测(ce)


            image.png

            图4  NOD背景(jing)(Sirpa基因)检测


(3) T、B和NK细胞检测

image.png

图5  NPG小(xiao)(xiao)鼠缺失有功能的(de)T、B和(he)(he)NK细胞(bao)(bao)。流(liu)式分析B6, Balb/c nude和(he)(he)NPG小(xiao)(xiao)鼠外周血中(zhong)CD3+ CD4+ or CD3+CD8+ T 细胞(bao)(bao) , B220+ B 细胞(bao)(bao)和(he)(he)NKp46+ NK 细胞(bao)(bao)的(de)含量。



(4) 造血干细胞移植重(zhong)建和肿瘤细胞移植数据


 ① NPG小(xiao)鼠移植人造血干(gan)细胞效(xiao)果显(xian)著优于(yu)NOD-scid小(xiao)鼠。


 image.png

图6 NPG和(he)NOD-scid小鼠(shu)移(yi)植人造血干细(xi)(xi)胞(bao),第(di)12周(zhou)时人CD45+细(xi)(xi)胞(bao)嵌合率分析。左图为移(yi)植后12周(zhou)时外(wai)周(zhou)血中人CD45+细(xi)(xi)胞(bao)比例(li)的流(liu)式分析结果;右图为骨髓中人CD45+细(xi)(xi)胞(bao)的比例(li)。

 


②人造血干细胞(HSCs)移植NPG小鼠高水平(ping)重建造血系统

图7  NPG小(xiao)鼠移(yi)植人造血(xue)干细(xi)胞(HSCs)后,可(ke)以高水平重建造血(xue)系统。左图为将 5×104脐带血CD34+细胞通过骨髓移植入6-8周的NPG小鼠后检测(ce)结果; 右图为1×105脐带血CD34+细胞移植后16周在(zai)NPG小(xiao)鼠脾(pi)脏(zang)中检测到高(gao)水平的(de)人(ren)CD45+细胞



③人造血干细(xi)胞(HSCs)移植NPG小鼠后重建各系造血细(xi)胞比例检测

image.pngimage.pngimage.pngimage.png

图8人(ren)造血干细(xi)胞(bao)(bao)(bao)(HSCs)移植NPG小鼠后获得各(ge)系(xi)(xi)造血细(xi)胞(bao)(bao)(bao)分化(hua)的(de)(de)高水(shui)平重(zhong)建。上图显(xian)示的(de)(de)为将5×104脐带血CD34+细(xi)胞(bao)(bao)(bao)移植16周(zhou)后,在NPG小鼠外周(zhou)血中(zhong)检测(ce)到高水(shui)平的(de)(de)人(ren)CD45+细(xi)胞(bao)(bao)(bao)(46.54%)、CD19+ B细(xi)胞(bao)(bao)(bao)(70.9%)、CD3+ T细(xi)胞(bao)(bao)(bao)(17.33%)和CD33+髓系(xi)(xi)细(xi)胞(bao)(bao)(bao)(8%)。



333.pngimage.png

图(tu)9 人造血(xue)(xue)干(gan)细(xi)胞(bao)(HSCs)移(yi)植(zhi)NPG小(xiao)鼠后各系细(xi)胞(bao)重建。脐带血(xue)(xue)CD34+细(xi)胞(bao)移(yi)植(zhi)NPG小(xiao)鼠12周(zhou)以(yi)及更长时(shi)间之后,人源造血(xue)(xue)细(xi)胞(bao)稳定重建,T细(xi)胞(bao)所占(zhan)比例逐(zhu)渐升高。



④NPG小(xiao)鼠肿(zhong)瘤免(mian)疫治疗的相(xiang)关研究


image.png       image.png

图(tu)10 人肿瘤细胞移植NPG小鼠后更容易成瘤。上图为使用NPG小鼠和BALB/c裸鼠,皮下接种人黑色素瘤细胞A375SM后,活体成像的肿瘤示踪图,可见NPG小鼠成瘤,与裸鼠相比,大小更均匀,生长到一定体积需要的时间相对更短。



4. 应(ying)用领(ling)域

(1)人源细(xi)胞或(huo)组织移(yi)植(zhi)

(2)肿瘤和肿瘤干(gan)细胞(bao)研究(jiu)

(3)ES和iPS细胞研究

(4)造血和免疫学研究

(5)人类疾病感染模型研究

(6)人源化动物模型研发


5. 参考文献

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