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冻存和复(fu)苏

保种(zhong)服务(wu)是指,通过在液氮中保存(cun)实(shi)验(yan)动(dong)物(wu)的(de)配子或胚胎(tai),从(cong)而实(shi)现(xian)以较(jiao)小的(de)成(cheng)本维持动(dong)物(wu)模型核心种(zhong)群的(de)方法(fa)。im体育通过冻存(cun)精子,胚胎(tai)或卵巢组织(zhi),需要时(shi)再(zai)复(fu)苏成(cheng)活体动(dong)物(wu),确保客户种(zhong)质资(zi)源的(de)安全。


1.胚胎冻(dong)存

胚胎冻(dong)存(cun)是安全的(de)保存(cun)实验动物品(pin)系的(de)方(fang)法。影响胚胎冷冻(dong)保存(cun)成功的(de)三个重要(yao)方(fang)面包括:①胚胎的(de)数(shu)量(liang)(liang);②复苏后(hou)(hou)存(cun)活(huo)胚胎的(de)数(shu)量(liang)(liang);③胚胎移植后(hou)(hou)存(cun)活(huo)的(de)成年动物数(shu)量(liang)(liang)。

im体育建(jian)议客(ke)户每个品系冻(dong)存约200~300枚(mei)2cell、8cell或桑囊胚(pei)时期(qi)的胚(pei)胎(tai),每管(guan)30枚(mei)左右,即8~10管(guan)胚(pei)胎(tai)放入(ru)液氮中(zhong)保存。胚(pei)胎(tai)的来源,既(ji)可(ke)以通过超数(shu)(shu)排卵的方法,或者通过体外(wai)受精(IVF)的方法获得(de)。当然(ran),也可(ke)以与品系净(jing)化结合起来,这样可(ke)以节约获得(de)足量数(shu)(shu)目胚(pei)胎(tai)的准备(bei)成本。


该技术的(de)流程包括:

①胚胎采集。im体育建(jian)议冻存2-cell胚胎。若(ruo)2-cell胚胎复苏效(xiao)果不佳,再考(kao)虑冻存8cell或桑囊胚时(shi)期的胚胎。

②胚胎(tai)清洗。我们(men)采用国(guo)际胚胎(tai)移植协(xie)会的建议方案进行清洗,目的是防止(zhi)胚胎(tai)被(bei)微(wei)生物(wu)感染。

③胚胎冻(dong)存(cun)。采用玻璃化冷冻(dong)进(jin)行(xing),按照标准(zhun)的流程(cheng)经过(guo)冻(dong)存(cun)保护液处理后,投(tou)入(ru)液氮保存(cun)。

④复(fu)苏(su)验(yan)证(zheng)。冻(dong)存(cun)(cun)(cun)一周后,我们(men)取出(chu)1支验(yan)证(zheng)管的胚(pei)胎进行复(fu)苏(su),若(ruo)胚(pei)胎存(cun)(cun)(cun)活(huo)率(lv)和囊(nang)胚(pei)发育(yu)率(lv)20~100%(野生型B6小鼠胚(pei)胎复(fu)苏(su)率(lv)在(zai)80%以上,不同品系间(jian)存(cun)(cun)(cun)在(zai)差异(yi)),或(huo)胚(pei)胎移植后有健(jian)康小鼠出(chu)生,表(biao)明胚(pei)胎冷冻(dong)保存(cun)(cun)(cun)成(cheng)功。若(ruo)2-cell复(fu)苏(su)存(cun)(cun)(cun)活(huo)率(lv)小于50%,我们(men)会及时(shi)与客(ke)户沟通,更改为8-cell或(huo)桑囊(nang)胚(pei)期胚(pei)胎冻(dong)存(cun)(cun)(cun)。

⑤长期保(bao)(bao)存(cun)(cun)(cun)。验证保(bao)(bao)存(cun)(cun)(cun)成功的品系,放入专用(yong)的胚胎保(bao)(bao)存(cun)(cun)(cun)液氮罐中(一般分(fen)布于2个液氮罐),长期保(bao)(bao)存(cun)(cun)(cun)。


2.精子冻存 

精子冻存,在(zai)保种服务中广泛(fan)应用,其优势(shi)在(zai)于技术(shu)成熟,成本低,容易操作等特(te)点。通(tong)过无菌手术(shu)分离(li)(li)可育雄鼠的(de)(de)附睾,在(zai)特(te)定的(de)(de)溶液进行精子的(de)(de)游(you)离(li)(li),并加入专用的(de)(de)冷(leng)冻保护液,通(tong)过麦管冷(leng)冻保存在(zai)液氮中。

建议(yi)客户每个品系(xi)提供2~3只12周至4月(yue)龄(ling)的(de)可育成年小鼠,冻存(cun)15~20支麦管(guan)的(de)精液。

 

3.品系恢(hui)复

在基因(yin)修饰动物模型的使用过程中,由于(yu)各种原因(yin)造(zao)成该品系的繁(fan)育出现障碍,如由于(yu)老龄化(hua)造(zao)成精(jing)子活力(li)的降(jiang)低,或(huo)由于(yu)疾病(bing)或(huo)意外造(zao)成繁(fan)育期动物生命(ming)垂危,这时可以通(tong)过im体育提(ti)供胚胎复苏、精(jing)子复苏,或(huo)者辅助生殖技术进行动物品系的恢复。

(1)胚胎复(fu)苏(su)

冻存(cun)的胚胎(tai)按照标(biao)准程(cheng)序复苏后,移植(zhi)到代孕大小鼠的输(shu)卵管或(huo)子宫内,得到活体(ti)后代的过程(cheng)。

(2)精子复苏(su)

体(ti)(ti)外受(shou)精(jing)是指将成熟的(de)(de)卵子和(he)获能的(de)(de)精(jing)子在体(ti)(ti)外进行受(shou)精(jing)的(de)(de)过程。im体育有(you)丰富的(de)(de)作体(ti)(ti)外受(shou)精(jing)的(de)(de)经验(yan),建议(yi)精(jing)子活力大于30%时,直接采用体(ti)(ti)外受(shou)精(jing)方法复苏后代。

(3)辅助透(tou)明(ming)带切开(kai)体外受精

辅助透明(ming)(ming)带切(qie)开是指获得(de)(de)的精(jing)(jing)子(zi)活力小于30%时,精(jing)(jing)子(zi)不能顺利(li)穿过透明(ming)(ming)带,采用(yong)传统的方法(fa)(fa)不能得(de)(de)到受(shou)精(jing)(jing)卵时,对卵母细胞(bao)的透明(ming)(ming)带进行打(da)孔或(huo)切(qie)开,从(cong)而获得(de)(de)受(shou)精(jing)(jing)卵的方法(fa)(fa)。im体育可(ke)以采用(yong)Xyclone激光破膜仪(yi)进行透明(ming)(ming)带打(da)孔,或(huo)者(zhe)用(yong)专用(yong)的尖(jian)针将透明(ming)(ming)带切(qie)开,两种方法(fa)(fa)均可(ke)得(de)(de)到较高(gao)的受(shou)精(jing)(jing)率。