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基因编辑类(lei)型

基因编辑(ji)类型

根据研(yan)究的(de)(de)(de)(de)(de)不同(tong)目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de),需(xu)要制备(bei)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)的(de)(de)(de)(de)(de)动物(wu)模(mo)型(xing)(xing)。当为(wei)了研(yan)究基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)功能(neng)时(shi)需(xu)要过表达或(huo)敲(qiao)除(chu)相(xiang)应基(ji)因(yin)。如果(guo)全身敲(qiao)除(chu)目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)会导致(zhi)动物(wu)死亡时(shi),或(huo)需(xu)要在特定的(de)(de)(de)(de)(de)组织(zhi)敲(qiao)除(chu)基(ji)因(yin)时(shi),可(ke)以(yi)制备(bei)条件敲(qiao)除(chu)小(xiao)鼠。为(wei)了建立基(ji)因(yin)突变模(mo)型(xing)(xing)时(shi),制备(bei)点突变动物(wu)模(mo)型(xing)(xing)。制备(bei)基(ji)因(yin)人源(yuan)化小(xiao)鼠时(shi),可(ke)以(yi)进(jin)行(xing)人源(yuan)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)替换。制备(bei)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)动物(wu)模(mo)型(xing)(xing),需(xu)采用相(xiang)应的(de)(de)(de)(de)(de)策略,才能(neng)成功获得目(mu)标模(mo)型(xing)(xing)。

全身(shen)性敲除

基(ji)因敲(qiao)除是研(yan)究(jiu)基(ji)因功能的(de)重要方(fang)(fang)法。传(chuan)统ES打靶(ba)敲(qiao)除方(fang)(fang)法,周(zhou)期长,费用高(gao)。CRISPR/Cas9在基(ji)因敲(qiao)除方(fang)(fang)面的(de)优势:效(xiao)率(lv)高(gao),时间短,24天直接(jie)获得基(ji)因敲(qiao)除小(xiao)鼠。


技术一般的流程

设计合成gRNA→ 显(xian)微(wei)注射(she)→ 小鼠出生(sheng)检测。


技术(shu)优势或适合应用的研(yan)究(jiu)

-效率高,可达90%的敲除效率,并且有一定纯合敲除比例。

-方便检测,从PCR条带的大小,容易区分是否发生敲除。

-时间短,24天获得基因敲除小鼠。

-不受敲除片段大小限制,从几十bp到Mb长度的DNA,都能有效敲除。


成功案例


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图1:两个Grna切割位点之(zhi)间的~550bp基因序(xu)列被敲(qiao)除,PCR检测,相对(dui)于野生带773bp,发(fa)生敲(qiao)除的鼠产生~220bp的条带(箭头指向(xiang)的条带)。


​条件性敲(qiao)除

当基(ji)因(yin)敲(qiao)除会(hui)导致小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)死亡时,需要(yao)条件(jian)敲(qiao)除,才能(neng)获得(de)成体小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)用于研(yan)究。条件(jian)敲(qiao)除一般使(shi)用Cre-loxp系统,其方(fang)法是在基(ji)因(yin)的(de)(de)关键区域(yu)的(de)(de)两侧,插入loxp。loxp小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)制(zhi)(zhi)备好后,与Cre小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)杂交,获得(de)loxp纯(chun)合,Cre阳(yang)性的(de)(de)小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu),这种小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)在Cre的(de)(de)作用下,loxp发生(sheng)重组,中(zhong)间(jian)的(de)(de)序列(lie)被删除,达到敲(qiao)除基(ji)因(yin)的(de)(de)目(mu)的(de)(de)。目(mu)前已(yi)经(jing)有数百种Cre工(gong)具小(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu),可以根据研(yan)究需要(yao),购买或定制(zhi)(zhi)Cre工(gong)具鼠(shu),在不同的(de)(de)组织器官,达到敲(qiao)除目(mu)的(de)(de)基(ji)因(yin)。Cre融(rong)合ER/ERT2后,可以使(shi)用tamoxifen调控Cre入核,实现(xian)时间(jian)上的(de)(de)调控删除。


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图1:通过CRISPR辅助,在(zai)关键外显(xian)子(zi)的(de)(de)两(liang)(liang)侧通过同源重组,插入两(liang)(liang)个loxp,在(zai)Cre的(de)(de)作用下,loxp之间的(de)(de)外显(xian)子(zi)被删除,实(shi)现(xian)基因条件敲除。


技(ji)术一(yi)般的流程

打靶载(zai)体设计→ 载(zai)体构建→ 显微注射(she)(EPS打靶)→ 小鼠鉴定(ding)。


技术(shu)优势或适合应用(yong)的研究

-用于敲除致死的基因

-非致死基因,用条件敲除也可以在不同的组织,不同的时间敲除基因,获得更多的实验数据。


成功案例(li)

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图2:在关(guan)键外(wai)显子或非(fei)3整数(shu)倍的外(wai)显子两侧(ce)敲入(ru)loxp,在Cre的作用下,该区(qu)域(yu)被删除(chu),导致基因敲除(chu)。


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图3:设计Loxp插入(ru)位点的(de)特异引物(wu)与同源臂外侧的(de)引物(wu),通过PCR,可以检测到(dao)两个loxp被正确敲入(ru)到(dao)目的(de)位置,证明(ming)获得条(tiao)件敲除小鼠(shu)。



随机转基因

随机转基(ji)(ji)(ji)因是一种经(jing)典的(de)过表达基(ji)(ji)(ji)因小鼠(shu)制(zhi)备策略,不同于靶向基(ji)(ji)(ji)因编辑,没(mei)有受到(dao)新兴(xing)基(ji)(ji)(ji)因编辑技术的(de)影(ying)响。该方(fang)法通过将基(ji)(ji)(ji)因随机整合到(dao)基(ji)(ji)(ji)因组中,实(shi)现目的(de)基(ji)(ji)(ji)因过表达。


技术一般的流程

过表(biao)达载体(ti)构建(jian)(jian)→ 显微(wei)注(zhu)射→ 小鼠(shu)鉴定筛选→ 表(biao)达检测→ 品系建(jian)(jian)立。


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图1:转基(ji)因载体和小(xiao)鼠制备流程。


技术(shu)优势或适合应用的研究

-可以广谱,或组织特异过表达目的基因。

-多拷贝插入,比定点插入表达量更高。

-受整合位置影响,可能表达沉默,或者表达谱错误。


成功(gong)案(an)例

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图2:通(tong)过转基因载体特异的引物设计(ji),检测到(dao)转基因阳性的小鼠,一般效率在10-20%。


定点(dian)转基因

定(ding)点(dian)(dian)转基(ji)(ji)因(yin)(yin)是(shi)将转基(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)达(da)(da)(da)(da)载体敲入到Rosa26位点(dian)(dian),该位点(dian)(dian)被(bei)证明是(shi)在所有组(zu)织细胞都活跃的(de)区域,不会发(fa)生随机转基(ji)(ji)因(yin)(yin)中出现(xian)的(de)转基(ji)(ji)因(yin)(yin)沉(chen)默的(de)现(xian)象(xiang)。常(chang)用(yong)来制作过表(biao)达(da)(da)(da)(da)或条件过表(biao)达(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)鼠。条件过表(biao)达(da)(da)(da)(da)是(shi)在目的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)前(qian)面插入loxp包围的(de)Stop序(xu)列,阻止目的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)达(da)(da)(da)(da)。该小(xiao)(xiao)鼠模型(xing)与Cre小(xiao)(xiao)鼠杂交,能够在Cre表(biao)达(da)(da)(da)(da)的(de)组(zu)织中,删(shan)除Stop序(xu)列,从而使目的(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)发(fa)生表(biao)达(da)(da)(da)(da);过表(biao)达(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)鼠直接获得组(zu)成性基(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)达(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)鼠。im体育的(de)Rosa26位点(dian)(dian)的(de)定(ding)点(dian)(dian)转基(ji)(ji)因(yin)(yin)系统(tong),已经实现(xian)长达(da)(da)(da)(da)10kb的(de)定(ding)点(dian)(dian)转基(ji)(ji)因(yin)(yin)。


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图1:Rosa26位置敲入转(zhuan)(zhuan)基(ji)因表达载体,制备定(ding)点转(zhuan)(zhuan)基(ji)因小鼠.



基(ji)因敲入(ru)

基(ji)因敲入(ru)(ru)是指在基(ji)因组的(de)特定(ding)位置插(cha)(cha)入(ru)(ru)一(yi)段DNA序列,例(li)如给基(ji)因加GFP荧光(guang)标(biao)签标(biao)记蛋(dan)白(bai),原位敲入(ru)(ru)制备Cre工(gong)具鼠等应用(yong)。1kb以下的(de)小片(pian)段插(cha)(cha)入(ru)(ru),CRISPR/Cas9效(xiao)率较(jiao)高。对于大片(pian)段的(de)基(ji)因插(cha)(cha)入(ru)(ru),需要使用(yong)ES,或者EPS制备策略才能保证项目周期和效(xiao)率。


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图1:把绿(lv)色荧(ying)光(guang)蛋白(bai)敲入(ru)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)的(de)C端,融合表达,示踪(zong)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)。


技术一(yi)般的流(liu)程+图解

打(da)靶载(zai)体设计→ 载(zai)体构(gou)建→ 显微注(zhu)射(EPS打(da)靶)→ 小(xiao)鼠鉴定。


技术优势或适(shi)合应用的(de)研究

-CRISPR用于(yu)小片段的基因敲入。

-ES/EPS用于大片段基因敲入(ru)。

-给基因加(jia)各种标签(qian),原位(wei)敲入制备(bei)Cre工具鼠。


基(ji)因替换

基因替换指(zhi),根据研究需要,将小鼠的基因替换为其它物种的基因。可(ke)以(yi)将基因的部分(fen)功(gong)能区,或(huo)者全基因进行替换。1kb以(yi)下的小片段替换,可(ke)以(yi)采用(yong)CRISPR/Cas9策(ce)(ce)略。对于大(da)片段的基因替换,需要使用(yong)ES,或(huo)者EPS制备策(ce)(ce)略才能成功(gong)。


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图(tu)1:用其它种系的基因,替换小鼠的基因片段。


技术一般的流(liu)程+图(tu)解

打(da)靶载体设计→ 载体构(gou)建(jian)→ 显微注射(EPS打(da)靶)→ 小鼠(shu)鉴定。


技术(shu)优势或适合(he)应(ying)用的研(yan)究(jiu)

-CRISPR用(yong)于小(xiao)片段的基因替换。

-ES/EPS用(yong)于大片段基(ji)因替换(huan)。


3)基(ji)因(yin)人源化小(xiao)鼠的(de)制备(bei),如PD1等免(mian)疫检查(cha)点人源化小(xiao)鼠的(de)制备(bei)。


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图1 EPS小片段敲入效率高(gao)达90%


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图2 EPS系统(tong)对于长达20kb的大片段敲入,也具有很高的效率。


点突变(bian)

许多疾病(bing)由氨(an)基(ji)酸(suan)突变引起,为了构建此类疾病(bing)模型(xing),可以将小鼠的(de)对应基(ji)因的(de)位点进行突变。单链DNA在点突变方面有(you)较高的(de)成功率。


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图1 单链DNA模板(ban)制备点突(tu)变小(xiao)鼠。


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图2 PCR扩增包含(han)突(tu)变位点的序(xu)列,测(ce)序(xu)检测(ce)发生点突(tu)变的小鼠,目标碱基出现套峰,证明获得(de)杂合突(tu)变小鼠。


技术一般(ban)的流(liu)程

gRNA设计→ 供体DNA合成→ 显(xian)微注(zhu)射(EPS打(da)靶)→ 小鼠鉴(jian)定。


技术(shu)优势或适合应用的研(yan)究(jiu)

-氨基酸突变类小鼠疾病模型模拟

-CRISPR点突变效率相对较高