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基因(yin)编辑技术(shu)

im体育公司(si)拥有4种(zhong)主要(yao)基因(yin)修饰(shi)技术,可根据您(nin)的(de)实(shi)验要(yao)求,量身设计方案,采用合(he)适的(de)编辑方法(fa),准(zhun)确,高效的(de)制备目标动物模型(xing)。

基(ji)因编辑(ji)技(ji)(ji)术(shu)核心技(ji)(ji)术(shu): • ES 细胞打靶• EPS细胞打靶• CRISPR/Cas9技术• 病毒转基因
ES 细胞打靶(ba)

ES细胞(bao)(bao)是全能胚胎(tai)干细胞(bao)(bao),该细胞(bao)(bao)可以(yi)通过胚胎(tai)嵌合,获(huo)得(de)(de)ES细胞(bao)(bao)来源的小鼠(shu)(shu)。因(yin)(yin)(yin)此可以(yi)在(zai)ES上进(jin)行(xing)基(ji)因(yin)(yin)(yin)编辑,获(huo)得(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)修(xiu)饰小鼠(shu)(shu)。该方(fang)法在(zai)CRISPR等技术出现之前(qian),是主流获(huo)得(de)(de)靶向(xiang)基(ji)因(yin)(yin)(yin)修(xiu)饰小鼠(shu)(shu)的方(fang)法。


技术一般的(de)流程

载体构(gou)建→ 电转ES→ 克隆(long)鉴定→ 嵌(qian)合(he)鼠制备→ ES小鼠获得

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图1 经典ES打(da)靶(ba)制备基(ji)因修饰小(xiao)鼠模型流(liu)程,目前im体育可提供2种遗传背景的小(xiao)鼠ES细胞:C57BL/6,B6;129。



EPS细胞(bao)打靶

EPS细(xi)胞是一(yi)种(zhong)全能(neng)性比普通ES更(geng)高(gao)的(de)干细(xi)胞。相(xiang)比于(yu)(yu)普通ES具(ju)有种(zhong)系(xi)传(chuan)递(di)能(neng)力强(qiang),打靶效(xiao)率高(gao)的(de)特点。它可以有效(xiao)缩短基因小(xiao)(xiao)鼠制备(bei)周(zhou)期(qi),降(jiang)低制备(bei)费用。在制备(bei)基因敲(qiao)入(ru),条件敲(qiao)除方面,效(xiao)率显(xian)著(zhu)高(gao)于(yu)(yu)CRISPR法,更(geng)为(wei)重(zhong)要(yao)的(de)是不受敲(qiao)入(ru)片段大小(xiao)(xiao)限制,是一(yi)种(zhong)新型(xing)高(gao)效(xiao)的(de)基因修饰大小(xiao)(xiao)鼠制备(bei)策(ce)略。

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图(tu)1 EPS制备(bei)基因修饰(shi)小鼠流程图(tu)。


技(ji)术优(you)势或适合应用的研究

-在制备基因敲入,条件敲除方面,效率显著高于CRISPR/Cas9法。

-更为重要的是不受敲入片段大小限制。

-对于需要多次打靶的复杂动物模型,制备周期更短。


ES VS. EPS细胞打靶技术

EPS:im体育研究EPS技(ji)术,成(cheng)功将EPS应用于(yu)基(ji)因编辑小鼠快(kuai)速制备中,EPS是(shi)潜能拓展的(de)多功能干细胞,2017年在cell上(shang)发表该项(xiang)研究成(cheng)果,期刊号(hao):169(2):243-257.e25.

-ES打靶效率一般在百万分之一的级别,与之相比,EPS基因打靶效率提高几十倍到上百倍。

-同时EPS因为更高的全能性,具有更强的种系传递能力,低至1颗EPS细胞,就可一步获得嵌合效率接近100%的ES小鼠,省去种系传递过程(三个月)。

-与CRISPR辅助技术相比,使用EPS细胞不再受限于敲入片段(duan)大小,周期可控(kong),结(jie)果可预测(ce)。


EPS和ES策略流程

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CRISPR/Cas9技术

CRISPR/Cas9能够靶向基(ji)因(yin)组的特(te)定序列(lie),并且将DNA双链打断,引发(fa)非同(tong)源末端修(xiu)复,提高同(tong)源重组修(xiu)复效(xiao)率。可(ke)用于基(ji)因(yin)敲除,小片段基(ji)因(yin)敲入和基(ji)因(yin)条件敲除等基(ji)因(yin)编辑。


技术一般(ban)的流(liu)程

载体构(gou)建→设计(ji)制备gRNA→微(wei)注射→出(chu)生小(xiao)鼠(shu)检测→阳(yang)性小(xiao)鼠(shu)获(huo)得(de)。


技(ji)术优势或(huo)适合(he)应用(yong)的研究

-高效率基因敲除,双gRNA策略能够删除大片段DNA,从几十bp到Mb,几乎没有长度限制。

-基因敲入严重依赖片段长度,1kb以上,敲入效率急剧下降。

-点突变等小范围基因编辑效率高。


成功案例


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图1 双gRNA切割,片段(duan)敲除基因方(fang)案设计(ji)。

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图2 两个Grna切(qie)割位点之(zhi)间(jian)的~550bp基因序列被高效(xiao)率敲(qiao)(qiao)除,相(xiang)对(dui)于野生带773bp,发生敲(qiao)(qiao)除的鼠PCR产生~220bp的条带。


病毒转基因

脂质体细(xi)(xi)(xi)胞(bao)转(zhuan)基因方法(fa)是常(chang)用(yong)的方法(fa),但对于一些肿瘤细(xi)(xi)(xi)胞(bao)系,效率极低。病(bing)(bing)毒(du)(du)转(zhuan)基因成为(wei)有效的替代(dai)方案,常(chang)用(yong)的有慢病(bing)(bing)毒(du)(du),腺(xian)病(bing)(bing)毒(du)(du)方法(fa).慢病(bing)(bing)毒(du)(du)会把外源基因整(zheng)合到细(xi)(xi)(xi)胞(bao),常(chang)用(yong)来(lai)建立转(zhuan)基因细(xi)(xi)(xi)胞(bao)系、细(xi)(xi)(xi)胞(bao)荧光标记等用(yong)途。腺(xian)病(bing)(bing)毒(du)(du)不整(zheng)合到基因组,可以(yi)用(yong)来(lai)瞬(shun)时转(zhuan)染细(xi)(xi)(xi)胞(bao)。腺(xian)病(bing)(bing)毒(du)(du)制备(bei)较慢病(bing)(bing)毒(du)(du)复杂(za),周期(qi)长。


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图1 通过慢(man)病毒,把luciferase转(zhuan)到Raji细胞,建立稳转(zhuan)细胞系(xi)。